菌种保藏要求及方法（含具体操作）

一、菌种保存要求

应针对不同保藏菌株确定适宜的保藏方法：同一菌株应选用两种或两种以上方法进行保藏；只能采用一种保藏方法的菌株或细胞株应备份并存放于两个以上的保藏设备中；菌种保藏方法参照相应的标准操作规程；菌种的入库和出库应记录入档，实行双人负责制管理；重要菌种应应异地保存备份；高致病性病原微生物和专利菌种应由国家制定的保藏机构保藏；菌种保藏设施应确保正常运行，设专人负责管理，定期检修维护；菌种保藏设施应备有备用电源，防止断电事故发生。

由标准储备菌株构建工作菌株流程图

二、菌种保藏方法

菌种保藏方法多种多样，有的复杂，有的简单实用。保藏效果也不尽相同。选择何种保藏方法取决于实验室现有的设备和保藏要求。

1.传代培养法

保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，将菌种管的棉塞换成橡胶塞，用石蜡封口，至于4℃冰箱中或室温下存放，定期进行传代培养。当固体斜面或液体培养物用尽后，可从半固体穿刺培养物中接种斜面再培养后保存，但要注意无菌操作。

保藏的时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2个月~4个月移种1次，酵母菌间隔2个月，普通细菌1个月，假单胞菌2周传代1次。此法优点是操作简单、使用方便，无需特殊设备，缺点是包场时间段、易被污染和发生变异。

2.液体石蜡保藏法

原理是在菌的培养物表面覆盖液体石蜡隔绝空气，防止培养基水分的蒸发，降低呼吸作用，减少能量和物质代谢，延缓细菌的衰老，延长保存时间。

将化学纯的液体石蜡油置于三角瓶中，高压灭菌后，放于40℃烘箱中过夜，烘去水分，加在已长好菌的斜面或半固体上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝，管口换成无菌的橡皮塞。将试管直立，置4℃或室温下保存。

此法使用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢杆菌可保藏2年以上，酵母菌可保藏1年~2年，普通细菌也可保藏1个月~1年左右。注意：从液体石蜡下面取培养物移种后须在火焰上灼烧时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅。

3.载体法

微生物菌体吸附在一定的载体上进行干燥后保藏。多用于产芽孢或孢子的微生物、芽孢杆菌、霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果好，可保存2年时间，但不能用于保藏营养细胞。

常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。

下面介绍砂土管保藏法的步骤：

（1）河沙处理

将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，将放入容器中用10%盐酸浸泡24h或加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，Zui后一次用蒸馏水冲洗，烘干或晒干，备用。

（2）土壤处理

取非耕作层不含腐殖质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。

（3）砂土混合

处理妥当的沙与土按2:1的比例掺和（或根据需要而用其他比例，甚至可全部作沙或土）均匀后，装入小试管或安剖瓶中，高度为1cm左右，塞上棉塞，进行灭菌（通常采用间歇灭菌2次~3次） ，Zui后烘干。

（4）无菌检查

每10支沙土管随机抽取1支，将沙土倒入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再做无菌试验，直至证明无菌后方可使用。

（5）悬菌液的制备

向培养好的斜面培养物中加入2ml~3ml无菌水，将菌苔洗下，制成菌悬液。

（6）分样样品

每支沙土管（注明标记后）加入0.5ml菌悬液（刚刚使沙土润湿为宜），拌匀。

（7）干燥

将装有悬菌液的沙土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂（五氧化二磷或无水氯化钙）。用真空泵抽干水分后火焰封口（也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口）。

（8）保存

置于4℃冰箱或室温干燥处，每隔一段时间进行检测。

（9）纯度检查

从做好的沙土管中，按10:1比例抽查。无菌条件下用接种环取出少量沙土粒，接种于适宜的固体培养基上，培养后观察其生长情况和有无杂菌生长。如出现杂菌或菌落数很少，或根本不长，则须进一步抽样检查。

（10）复活

无菌条件下打开沙土管，取部分砂土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次，也可沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。

4.悬液法

将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。

5.冷冻法

使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法（-30℃）、超低温法（-70℃）和液氮法。保存效果随保存温度越低而越好。此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。

下面以液氮法为例进行介绍：

（1）准备冻存管。冻存管需能耐受121℃高温高压灭菌又能在-196℃低温下长期存放，聚丙烯塑料制成的带有螺帽和垫圈的冻存管能满足要求，容量一般为2ml。冲洗、烘干、灭菌后备用。也可直接购买经灭菌处理的冻存管。

（2）准备保护剂。配制10%~20%的甘油或5%的二甲亚砜，灭菌，使用前进行无菌检查。

（3）制备悬浮液。取新鲜的生长好的斜面，加入2ml~3ml保护剂，用旋涡混合器或用接种环将菌苔刮下并用无菌移液器吹打制成菌悬液。

（4）分装悬菌液。用记号笔在冻存管上注明标号，分装悬液到冻存管中，每管0.5ml，拧紧螺帽。注意：如果螺帽密封不严导致液氮浸入冻存管，取出冻存管时可能发生爆炸。

（5）预冻。先将分装好的冻存管置4℃冰箱中30min后，再放入冰箱冷冻层（-20℃左右）20min~30min，然后快速转入-70℃超低温冰箱。也可用其他预冻方式：程序控制降温仪、干冰等。

（6）保存。将预冻后的冻存管迅速转入液氮罐液相中，并记录菌种在液氮罐中存放的位置。

（7）复活。戴上棉手套，从液氮罐中取出冻存管，用镊子夹住冻存管上端迅速放入37℃水浴中，融化后用无菌吸管吸取悬浮液到合适的培养基中培养。

6.真空干燥法

不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10℃~20℃范围内进行真空干燥。

7.冷冻真空干燥

冷冻真空干燥法是将要保存的微生物样品先经低温预冻，然后在抽真空减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。该方法是菌种保藏Zui有效的方法，适合大多数微生物，保藏效果好，保藏时间可达几年，甚至30年。

冷冻真空干燥的步骤：

（1）冻干管的准备：中性硬质玻璃，2%盐酸浸泡过夜，冲洗至中性，烘干，灭菌后备用。

（2）菌种培养至静止期或成熟期。

（3）保护剂的配制：可用脱脂乳粉和蒸馏水配制10%（质量浓度）脱脂乳液经115.6℃、20min灭菌后使用。还可用75%葡萄糖马血清肉汤溶液（无菌马血清300ml；葡萄糖30g；牛肉膏粉1.3g；蒸馏水100ml）。

（4）悬菌液的制备：2ml~3ml保护剂。

（5）分装样品：悬菌液每管0.2ml。

（6）预冻：一般预冻2h以上，温度达到-35℃~-20℃左右。

（7）冷冻真空干燥：-50℃下抽真空。一般为8h~20h。

（8）取出样品：轻敲松散即达标。

（9）熔封：在真空条件下将安剖瓶颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度，管内呈现灰蓝色光，即为保持着真空，电火花应射向安剖瓶的上半部，勿射向样品。

（10）存活性检测：抽取一管进行菌种纯度、存活性、形态等检查。

（11）保存：低温避光保存。

三、存活率的计算

分别将保藏前与保藏后的菌悬浮液按10倍稀释法涂布平板，培养后计算存活率，见下图。