菌种常用保藏方法及相关要点扩展

01-斜面低温保藏法

将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。

此法适用范围广（细菌、霉菌、放线菌、酵母均适用），操作简便，成本低廉，复苏方便，人员能随时对微生物的状态进行观察。缺点是保藏时间较短，需要经常传代处理，因连续传代而容易引入基因突变或者杂菌，培养基的理化性质及微生物代谢产物等原因还会导致微生物性状发生改变。

因此斜面低温保藏法适于短期保存常用菌株，而且应该与其他能够长期保存菌株的方法相结合防止种系丢失。

02-液体石蜡保藏法

此法是斜面低温保藏法的一种改进，只需将无菌干燥的液体石蜡注入上述培养好的斜面至高于斜面顶端1cm处，再将试管密封，直立于4℃左右冷藏保存，具体保存温度随菌种而变。注意要定期添加石蜡保证斜面处于液面以下。保藏时间至少可以达到1年（无芽孢细菌、酵母），甚至更长。

液体石蜡保藏法基本上克服了斜面低温保藏法保存时间短的缺点，然而液体石蜡保藏法由于要试管直立保存，因此比较耗费空间，不便于携带。

此法要注意以下两点：①石蜡要保证无水，干热160℃，2 h灭菌后的石蜡可直接使用， 若是用高压湿热121℃，20min灭菌法灭菌，则要置于烘箱中至水分蒸发，石蜡液体变澄清后再使用；②用接种环取种复苏时，注意接种环要充分冷却防止液体石蜡飞溅伤人。

03-半固体穿刺保藏法

配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。保存时间至少可以达到1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。

此方法主要适用于工程大肠杆菌等细菌，操作简便，保存时间较长，适用于实验室使用，保存时注意培养基的营养不宜过于丰富，以进一步降低细菌的代谢。此法也可以用石蜡对培养基进行液封从而延长保藏时间

04-沙土管保藏法

这种方法适用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用Zui广。保藏效果亦较好，可以达到2 年左右。但是此法对于营养细胞效果不好。操作的时候应该注意抽干一步务必要快，尽量在12h内完成，防止孢子萌发，降低保藏效果。

05-加入保护剂冻存保藏法

体积分数10%~20%甘油是Zui常见的菌种冻存保护剂，将成熟期菌种培养物制成悬浊液于冻存管中，加入一定体积的无菌甘油，使甘油的Zui终体积分数为10%~20%，密封。可以根据实验室的条件将菌种置于液氮，干冰， - 80 ℃冰箱，或者- 20 ℃冰箱中保存，温度越低保存时间越长。脱脂牛奶也可以作为某些菌株的冻存保护剂，用经过脱脂灭菌工序后的鲜牛奶洗去固体培养基上的菌苔，制成菌种悬浊液，于冻存管密封后冷冻保存。

加入保护剂冻存的方法操作比较麻烦，对设备要求相对较高，然而此法应用范围极广，除适用于一般微生物菌种保藏外，还适用于一些难以保存的微生物，如支原体、衣原体、氢细菌、噬菌体以及难于形成孢子的霉菌。在低温条件下微生物的代谢完全停滞，因此此法保存时间长，可以使微生物的遗传物质以及表观性状较为稳定。应用此法对微生物进行保藏的关键，一是选取Zui合适的保护剂；二是注意要“慢冻快化”：冷冻时降温速率保持1 ℃/min，复苏时用37 ℃水浴，能保证菌种Zui大的成活率。

06-冷冻真空干燥保藏法

将处于成熟期的微生物培养物（若微生物可以产生孢子，则应该尽量使微生物大量产生孢子）悬浮于无菌的血清、卵白、脱脂奶或者海藻糖等保护剂中制成浓菌液，分装到无菌的安瓿瓶中，于低温冰箱中冷冻，达到预定温度后对浓菌液进行冷冻干燥处理，之后在真空状态下融封安瓿瓶，于20 ℃保藏。

冷冻真空干燥法虽然操作复杂，需要使用冷冻干燥以及抽真空的设备，然而一旦保存好，则可以Zui小程度地减少微生物的改变、死亡和泄露扩散，因此适用于大批量菌种的长期保存，特别是一些致病微生物的保存。该法是各种保存方法中Zui为有效的方法之一，对于大多数微生物都适用，包括一些难于保存的致病菌，如脑膜炎球菌和淋病球菌。